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发表于 2016-10-23 15:47:02
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三、实验室处理的相关信息
1. 标本：应该新鲜，立即送检、立即处理。陈旧标本中白细胞（WBC）及一些菌体会溶解，杂菌过度生长会干扰结果判断。对痰普通细菌培养，实验室接到标本后需要进行质量判断。质量判断不合格，不必进行后续微生物学检查，标本拒收。一些特殊病原检查，比如结核菌或军团菌培养，不必进行质量判断。合格标本不必洗痰。有条件时，建议对痰标本进行液化处理，建议同时涂片。接种时不建议定量培养，规范半定量培养即可，参见卫计委行业标准《下呼吸道感染细菌培养操作指南》。
2. 涂片：专业而言，每1份进行痰细菌培养的标本都应该进行涂片镜检。注意这里指检查细菌和真菌，不是质量判断。国内实际情况涂片是临床医嘱，如果医嘱不到位，很多医院限于人力和收费，没有进行涂片检查，这是管理漏洞，也是专业漏洞。当然也不要走到另一个极端。重涂片而轻培养。涂片与培养是各自独立的不同检查，彼此都不是对方的前提，二者互为补充，结果要综合分析。
有涂片时，注意观察菌体（染色、形态），炎症细胞，菌体与炎症细胞二者关系，组织细胞，其他特征性形态等。观察到PMN（多形核粒细胞）中吞噬菌体现象是重要的感染特征。
革兰染色后吞噬现象的观察和判断需要注意：要区分并排除黏附现象；吞噬后菌体的染色、形态不完全等同于未被吞噬的菌体和纯培养的菌体；吞噬的菌体判断无法指向菌种；吞噬菌体与培养分离株建立关联时，要没有歧义（比如吞噬是革兰阴性杆菌，形态符合肠杆菌科。但培养有大肠埃希菌、阴沟肠杆菌相同多量生长，此时即歧义，因为无法确知吞噬的是什么，还是都有吞噬）。一般而言，除了极其特殊的情况外（比如男性生殖道分泌物革兰染色查见胞内的革兰阴性肾形双球菌），通过革兰染色镜下形态学识别进行菌种层面判断甚至临床确诊，属于常识性错误。
3. 特殊的定向培养：此时临床目的明确（比如结核分枝杆菌），需要特定的培养条件（特殊培养基、气体、温度、时间等）。如果条件满足，有分离株则一一判断、鉴定，有目的菌种则报告阳性。无生长或没有目的菌种，则报告阴性。
4. 咳痰和抽吸痰标本：不能做厌氧菌培养。
5. 口咽部正常微生物群：美国《临床微生物学操作规程（CMPH）》2007版（3.11.2.9）提到草绿色链球菌群、普通定植的奈瑟菌属、脑膜炎奈瑟菌、假白喉棒杆菌、血浆凝固酶阴性葡萄球菌（SCN）、罗氏菌属（Rothia）、F群链球菌、厌氧菌、嗜血杆菌属（不包括流感嗜血杆菌。原文“不包括”，其实该菌可以正常定植）、肠球菌属、假丝酵母菌属、艾肯菌属、放线杆菌属（Actinobacillus）、二氧化碳嗜纤维菌属（Capnocytophaga）、莫拉菌属。
6. 美国感染性疾病学会（IDSA）和美国微生物学协会（ASM）指南中的肺炎病原谱：社区获得性肺炎（CAP）：（1）细菌性：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肠杆菌科、铜绿假单胞菌、军团菌属、肺炎支原体、肺炎衣原体、混合厌氧菌（吸入性肺炎）、分枝杆菌（结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌）；（2）真菌：荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌（Coccidioides posadasii）、皮炎芽生菌；（3）病毒：流感病毒A/B、呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒、副流感病毒1-4、人偏肺病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒；（4）寄生虫：卫氏并殖吸虫。
医疗保健相关肺炎（HCAP）、医院获得性肺炎（HAP）、呼吸机相关肺炎：（1）细菌：铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属、粘质沙雷菌、不动杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、混合厌氧菌（吸入）、军团菌；（2）真菌：曲霉菌属；（3）病毒：流感病毒A/B、副流感病毒、腺病毒、RSV。
免疫低下患者肺炎：（1）细菌性：见上面CAP和HCAP细菌性病原。额外需要考虑的细菌：沙门菌属（非伤寒菌）、脑膜脓毒伊丽莎白菌、单核细胞增生李斯特菌、奴卡菌和其他需氧放线菌、马红球菌、结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌（M.xenopi）、嗜血分枝杆菌（M. haemophilum）、快生长菌如脓肿分枝杆菌；（2）病毒：呼吸道病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒；（3）真菌：伊氏肺孢菌、新型隐球菌、曲霉菌属、镰刀菌属、接合菌（如根霉属、毛霉属、犁头霉属）Pseudoallescheriaboydii、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、其他地方性真菌；（4）寄生虫：冈地弓浆虫、微孢子虫病（Microsporidiosis）病原Enterocytozoon bieneusi、隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）病原、粪类圆线虫（Strongyloidesstercoralis）。
7. CMPH分离株生长判断方式：无生长：规范培养基和培养条件，连续72 h无任何肉眼可见菌落，这在临床是少见现象。毕竟口咽部大量正常微生物群存在。而合格标本意味着污染轻，并不意味着没有污染。此时要与临床沟通，看是否存在环节错误。
只有正常微生物群生长：呼吸道正常微生物群一般不鉴定。只有呈纯生长时，才鉴定和做药物敏感实验，无论多少（1＋～4＋）。注意纯生长极为罕见，实际工作需要确认纯生长是否是假象。比如选择培养基上的生长要小心，因为在普通羊血琼脂上可能有第2种菌生长。然后一区的判断要小心，因为可能有覆盖。
下列菌种正常情况下可以在上呼吸道定植，如果它们的生长等于或少于呼吸道正常微生物群的生长，一般视为定植。只有呈中重度生长（3＋或4＋），并且多于呼吸道正常微生物群生长时，才鉴定和做药物敏感实验。包括：A群β溶血链球菌（化脓链球菌）、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌、B/C/G群，β溶血链球菌、棒杆菌属。
肠杆菌科分离株，1种或2种生长时，如果其生长等于或少于呼吸道正常微生物群的生长，则不必鉴定，除非患者处于免疫受损／抑制状态。如果呈中重度生长（3＋或4＋），并且多于呼吸道正常微生物群生长时，则鉴定和做药物敏感实验。
下列革兰阴性杆菌只有1种生长时，无论多少，都要鉴定和做药物敏感实验。包括巴斯德菌属、铜绿假单胞菌、其他非发酵菌（支气管炎脓毒博德特菌、嗜麦芽窄食单胞菌、不动杆菌属、洋葱博克霍尔德菌等）。
如果上面两类革兰阴性杆菌中不同菌种呈混合生长，即3种或3种以上同时生长，如果其生长等于或少于呼吸道正常微生物群的生长，则不必鉴定。如果呈中重度生长（3＋或4＋），并且多于呼吸道正常微生物群ICU或处于免疫受损／抑制状态，则都鉴定和做药物敏感实验（这不意味着优势菌必然是真正的致病菌）。
下列革兰阳性杆菌，无论多少，都要鉴定和做药物敏感实验。包括马红球菌（Rhodococcus equi）、需氧的放线菌（奴卡菌属、链霉菌属）。
下列真菌，无论多少，都要鉴定。包括新型隐球菌、非腐生性的丝状真菌（如曲霉菌属、毛霉属Mucor、引起系统性真菌病的菌种）。为什么要把实验室判断方式呈现出来呢？因为实验室和临床医生都需要知道游戏规则。对于实验室而言，上述CMPH中的规则，可能很多细菌学工作者不甚明了。而对于临床医生则常常有很多困惑。比如SCN痰培养分离株为什么不做鉴定和药敏——这是我们常遇到的问题。通过上面的规则我们知道，除非是真正的纯培养，痰SCN分离株不必做鉴定和药敏。如果临床想知道SCN的情况，需要升级标本为BALF或肺组织，靠痰无法判断。再比如为什么有时候肠杆菌科不做鉴定和药敏，而有时候做——这也是我们常遇到的问题。不做的原因，或者是量非常少（几个菌落或1＋），或者明显比正常微生物群少。
四、痰培养分离株对肺炎的诊断意义
1. 明确菌种致病性：临床分离株可以分为经典致病菌和条件致病菌。经典致病菌一般不是人体正常微生物群，在人体罕有定植，一经发现即是异常。如果有对应的临床表现，一般而言分离即可确诊。没有临床表现，存在也是重要的临床现象，要么是感染前的潜伏期，要么是隐性感染。如结核分枝杆菌、嗜肺军团菌。条件致病菌一般是人体正常微生物群，或可以在人体短暂定植。分离后可能不是感染。其分离株判断有一定难度，需要理解感染性疾病分
级诊断。
2. 感染性疾病的诊断分级：包括拟诊断（possible, suspected）、极似诊断（probable, presumptive）、确定诊断（proven, definite, confirmed）。三级诊断理念在病毒性疾病、真菌性疾病领域目前是业界热点，真菌学领域已经是指南基本理念。细菌性感染性疾病的诊断也可以分为三级。极似诊断指两种情况：（1）临床表现不明确，但微生物学证据明确；（2）临床表现明确，但只有初步的微生物学证据。前一种情况一般是监测状态。后一种情况为临床多见，具体指征据本身可信，但尚未明确微生物种属，或检查结果阳性预测值（PPV）低。中华医学会新版社区获得性肺炎（CAP）指南（即将发布）将微生物学证据（包括痰培养）分为：（1）可作为病原学确定诊断依据的检测结果；（2）对病原学诊断有重要参考意义的检测结果。第1点对应确诊，第2点对应本文的极似诊断。痰涂片见到吞噬菌体现象———不能明确种属、痰普通半定量培养分离的条件致病菌———阳性预测值低（50%左右），二者都是极似诊断层面证据。此时，分离的条件致病菌被称为可能致病菌（probable pathogen）。
3. 极似诊断证据（条件致病菌／可能致病菌）本身的价值：肺炎的临床表现分轻、中、重度。重症肺炎的判断方式见相关文献。对于重症肺炎，一般在临床诊断确立后，先初步判断可能的病原。根据判断结果，一方面采集标本（呼吸道分泌物、血液、胸腔积液、尿液等）采用多种检查积极获得病原学证据（除细菌外，还包括病毒学和真菌学证据等），另一方面基于严重程度根据可能的病原选择药物启动经验治疗。
而获得痰培养分离株种属信息，一般是在取材48 h后。此时经验治疗已经进行2 d。对于危重患者，应该已经进行了至少1次经验治疗疗效分析。__而其他病原学检查结果也已经部分回报。如果48 h后仍未确诊（甚至还有其他病原学检查结果未知），经验治疗疗效分析显示没有明显效果甚至病情进行性加重，经验治疗也没有覆盖痰培养分离株，则调整治疗需要覆盖该分离株。如果后续有其他明确的肯定性证据则确诊，治疗转换为靶向治疗。如果有明确的否定性证据，或其他停药指征，则停止针对性治疗。
这样是否会导致抗生素不合理使用？个人认为，如果危重判断明确有根据，经验治疗疗效欠佳而且没有覆盖，同时也在积极获得确诊的病原学证据这样的前提下，鉴于重症肺炎的病死率（CAP＞30%，并发脓毒症则可达50%），调整治疗先行覆盖是合理的。
4. 将极似诊断证据确定为真正病原的方法：
（1）同时血培养（肺部是唯一感染源）或胸腔积液培养、之后的支气管肺泡灌洗液（BALF）培养，有相同分离株分离。（2）痰涂片见到吞噬菌体现象，与培养结果相符且无歧义。（3）肺组织病理学查见菌体，相符且无歧义。（4）免疫学（抗原等）结果相符。如尿液肺炎链球菌抗原检查阳性，而痰中有肺炎链球菌分离。（5）分子生物学：肺组织标本结果相符则可以确定。
注意：上面后两种情况可以直接到种属，分离株还有意义吗？——有意义，因为可以做药敏试验。此外，经验治疗有效后通过抗生素活性谱反推病原，这是错误的理念。尤其是广谱抗生素的情况，更是错误。
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