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一、PCR的基本原理
（一）PCR的基本过程
PCR是一种体外扩增特异DNA片段的技术。它包括下列三个基本步骤：
1、变性（Denaturation）：待扩增的DNA模板加热变性成单链；
2、退火（Annealing）：降低温度，使单链靶序列与寡核苷酸引物退火；
3、延伸（Extension）：在适当条件下，利用DNA聚合酶使引物延伸，产生新的双链。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环，导致特异的靶序列的指数扩增。
PCR产物是介于引物的5’端之间的双链DNA片段。（二）PCR体系中的主要成份
1.Taq DNA 聚合酶 是一种耐热的DNA聚合酶，具有5’-3’DNA聚合酶活性，一般有5’-3外切酶活性，有或无3’-5’外切酶活性（校对活性），无校对活性的酶在PCR中错掺率较高。
PCR中 Taq 酶的用量一般为0.5-2.5U，过多易造成非特异性扩增，过少可能灵敏度不够。
2.寡核苷酸引物 是决定PCR扩增特异性的关键。
设计PCR引物时的几条原则：
①引物长度一般15-30 碱基，过短则特异性低；
②避免内部二级结构；
③G/C和A/T碱基均匀分布，G/C含量在45%-55% 之间；
④两个引物（特别是3’端）间不能发生互补，以免形成引物引物二聚体；
⑤引物的3’-端碱基一般应与模板严格配对，并且3’端为G、C或T时引发效率较高；
⑥引物的5’-端可添加与模板无关的序列（如限制性内切酶的识别位点、ATG起始密码子或启动子序列等）
PCR中所用引物浓度一般在0.1-0.5uM太高的引物浓度易造成非特异性扩增，太低会降低合成效率。
3、MgCl2 Mg2+浓度除影响Taq酶活性外，还影响双链DNA的Tm值，因而影响PCR的特异性和扩增效率。
PCR中的最适MgCl2浓度一般为1.5-2.5mM(注意游离Mg2+浓度还与能结合Mg2+的化合物如dNTP、EDTA 等的浓度有关。
4、脱氧核苷三磷酸（dNTP）一般采用均衡的dNTP浓度，4 种dNTP各为 200umol/L,dNTP可减少游离Mg2+，因此影响聚合酶活性和引物退火。
5、模板 单、双链DNA，以及RNA经逆转录合成的cDNA。
PCR样品可以是粗制品，但不应含有核酸酶和蛋白酶及其它干扰Taq酶活性的抑制剂 。
引物/模板的比率影响PCR的特异性。(三)PCR循环参数
1、预变性（Initial denaturation）．
模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。
2、引物退火（Primer annealing）
退火温度一般需要凭实验（经验）决定。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
3、引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。
延伸时间随扩增片段长短而定。
4、循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：
变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
5、循环数
大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
（四）PCR中的污染和假阳性
PCR中污染主要来自
1、样品间交叉污染；
2、先前PCR产物遗留（carry-over）二、几种常用特殊PCR技术
（一）逆转录PCR（Reverse transcription－PCR,RT-PCR）
RNA经逆转录后可作为PCR的模板.逆转录PCR（RT－PCR）常用于基因表达研究（定量PCR）和逆病毒检测．
设计RT－PCR引物时，应使引物分别位于不同的外显子中，以便区别cDNA和gDNA扩增产物。
（二）多重PCR（Multiple PCR）
在同一PCR反应体系中用多对引物（覆盖不同长度的靶序列）同时扩增。
例如用多重PCR进行DNA缺失筛选
(三) 套式PCR（nested PCR）
用第一次PCR扩增区域内部的第二对（套式）引物对第一次PCR产物再次扩增,可以增加特异性和灵敏度。
(四)非对称PCR（asymmetric PCR）
在PCR反应体系中，限制引物之一的浓度（50－100:1）进行扩增，可得到单链PCR产物,可用于制备单链测序模板或单链DNA杂交探针。
三、PCR与突变检测
通过PCR扩增片段的多态性分析有助于检测各种突变。
PCR扩增产物的多态性可分为三种类型：
1、限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism-RFLP）;
2、序列多态性(Sequence polymorphism);
3、长度多态性(Length polymorphism)
（一）PCR-RFLP分析
设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一或数个多态性的限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断，该方法主要用于检测各种已知突变。
（二）PCR结合ASO探针杂交分析
ASO（Allele specific oligonucleotide）探针：等位基因特异性寡核苷酸探针，指针对各种正常和突变靶序列设计的特异性寡核苷酸探针。
1、PCR产物变性后斑点印迹至膜上，用一系列AS0探针杂交，严格控制杂交和洗膜条件、确保正常ASO探针只与正常靶序列条交，而突变ASO只与含相应突变碱基的靶序列杂交。
2、另一种方法是将ASO探针固定在膜上，然后与生物素标记的PCR产物杂交-反向斑点杂交（reverse dot－blot），这样一次杂交可完成多个探针检测。
上述方法适用于基因组中某些固定位点上的已知序列差异的检测，如癌细胞中的ras突变，HLA typing等。（三）等位基因特异性扩增（A11eles specific amplification，ASA）-又称扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system，ARMS)
利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变，该法省去了探针杂交操作。
（四）PCR-SSCP分析
单链DNA在中性条件下，由于碱基配对等分子内相互作用而具有复杂的折叠构象，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，其迁移率除与长度有关外，还与其构象有关。DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同—单链构象多态性（Single strand conformation polymorphism，SSCP），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链得以分离。
PCR一SSCP的步骤：PCR扩增→产物热变性成单链→非变性PAGE→显示（放射自显影或银染等）
PCR－SSCP是检测点突变的简便灵敏方法，已用于多种遗传病、肿瘤中原癌基因和抑癌基因的突变分析，对＜200bp片段其灵敏度较好，靶序列增长时其灵敏度下降（一般175-345nt）。
（五）扩增片段长度多态性（Amp-FLP）
VNTR、STR等重复序列，因重复单位数目的不同而呈现高度多态。因此利用重复序列两侧的特异性引物进行PCR扩增，所得扩增片段具有高度多态性，这些不同长度的等位片段可用PAGE分离。
（六）PCR直接测序
DNA序列分析是检测基因突变最直接最可信的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质。PCR直接测序是指对PCR产物直接进行序列分析，而不是先将DNA待测片段克隆于测序载体上，这可大大的简化操作步骤。
PCR产物测序常采用循环测序法（cycle sequencing）：在PCR反应体系中同时将ddNTP加入，并利用同位素或荧光素标记的引物引导扩增，使模板的扩增与测序同时进行。应用PCR测序有以下优点：模板需要量小；方法简便，易自动化；测序效率高。四、PCR在基因诊断中的应用
（一）遗传病的基因诊断
目前已有近百种遗传病可用PCR技术进行诊断和产前诊断。用PCR对遗传病进行诊断的前提是对致病基因的结构必须部分或全部清楚。
.如利用PCR-RFLP或Amp-FLP对遗传病家系进行连锁分析，进而作出基因诊断。
（二）传染病诊断
PCR已应用于多种病原体的特异性检测和鉴定
1、病毒：如HBV，HCV，HIV，HPV等。
2、致病菌：如淋球菌、结核杆菌、军团菌、幽门螺杆菌、肺炎支原体等；
（三）肿瘤基因诊断
1、原癌基因和抑癌基因突变，如ras,p53；癌基因扩增和表达分析。
2、利用微卫星不稳定性，直接诊断肿瘤，如膀胱癌等；
3、分析白血病（如CML）中异常染色体易位，检测微小残留病变（Minimal residual disease，MDR）
4、肿瘤多药耐药性（multi-drug resistance,MDR）检测
5、端粒酶活性检测
技术
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发表于 2016-10-18 10:01:00
发表于 2016-10-18 10:01:01
