晓平说消毒：医疗机构环境表面微生物学监测之五：微生物实验注意事项

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专家：倪晓平

专栏编辑：丁韧


医疗机构环境表面微生物学检测技术之五：
微生物实验注意事项


在上一期的讲座中，倪教授重点讲解了现场采样的注意事项。如果说规范的标本采集是微生物学监测的前提，那么微生物实验技术就应该是最核心的环节了。


首先，微生物实验室人员应根据感染管理科或其他业务科室的工作计划，或突发事件的需求，尽早做好相关的实验准备，尤其是与实验有关的培养基和试剂的准备、质量控制等；特别需要提醒的是，由于微生物培养与分离时间的连续性的特点，因此，实验人员的工作安排也是微生物实验室的重要事项之一。




1.核对信息
收到来自临床一线环境的微生物标本时，应首先核对标本的基本信息，包括标本性质、质量、数量，以及再次确认事先商定的检测目的与项目等。因为，环境的消毒质量考核与感染来源调查实验具有较大的区别。实验人员应尽可能在2h之内实施实验。因为，标本中的细菌在室温下仍然可以继续增殖。


核对信息，明确检测目的


2.倾注培养
实验人员应在生物安全柜中进行标本的接种，先对采样管中的采样液进行充分震荡后，取采样液1mL（或根据以往的经验，做不同的稀释倍数）接种平皿，平行2块；用冷却至40℃～45℃熔化的营养琼脂培养基，每皿倾注15mL～20mL，置36℃±1℃恒温培养箱培养48h后计数。取细菌菌落数在30cfu/平皿～300cfu/平皿稀释度的平皿进行计数（菌落呈片状生长的平皿，不宜计数；如没有适合的稀释度，只得报告无法计数。），倾注培养仅适用于细菌菌落总数（CFU）的计数。在细菌菌落总数计数时，将2块平皿上的细菌菌落数进行计数，相加后除以2，再乘以采样液的数量，如采样液为10mL，即乘以10。如采样液经过倍比稀释后再接种的，计算结果时别忘了还需乘以稀释的倍数。实验应设阴性、阳性对照平皿。


实验人员在生物安全柜中接种标本


3.涂布培养
开展感染来源调查，需要寻找目标细菌的实验，应采用涂布法接种，即先将采样液进行充分震荡后，取250μm滴加至普通营养琼脂，或选择性培养基平皿（注：冷藏的平皿应事先在37℃培养箱中复温）上，连续滴加2块，或4块平皿，用无菌L棒均匀涂布后，置36℃±1℃恒温培养箱培养48h后计数。取细菌菌落数在30cfu/平皿～300cfu/平皿的稀释度的平皿进行计数。涂布法的平皿上发现典型菌落可以进行分离鉴定。


L棒涂布接种


同样，涂布法平皿也可以进行细菌菌落总数的计算，如某份标本共涂布了4块平皿，将4块平皿上的细菌菌落数分别计数，相加后乘以采样液的量，如采样液为10mL，即乘以10。如采样液经过了倍比稀释后再涂布接种，最终的结果计算时还需乘以稀释的倍数。实验应设阴性、阳性对照平皿。通常情况下，在同一个稀释度，由于涂布法接种的标本量较少（250μm），故平皿上菌落形态往往要大于倾注培养（1mL），前者便于计数。


左侧4块系涂布法（每皿接种250μm的量），4块平皿上细菌菌落数相加后，相当于右侧2块倾注培养皿相加后，除以2的结果。


4.注意事项
4.1采用倾注培养方法，应注意琼脂的温度不应过高；而涂布法接种的平皿，如平皿处于冷藏保存，一定要采取复温处理。这些看似小事，但对于细菌的良好生长影响较大。




4.2选择正确的中和剂，例如采用含氯、含碘、过氧化物类消毒剂，可采用0.1%硫代硫酸钠；戊二醛等醛类，采用0.3%甘氨酸；其他类型的消毒剂，采用0.3%卵磷脂+3%吐温80；也可以购买市售的广谱中和剂（通常为粉剂包装）。


4.3细菌菌落总数（CFU）的计算是多数单位不被重视的部分，通常我们看到最多是“0”报告，这样检测报告是不规范的。


规范的报告如下：
4.3.1环境表面采样面积为100cm2，采样液10mL。CFU计算执行GB 15982 A.3.5，倾注培养时，2块平皿均未长菌，计算结果为：0；报告时应为：＜1cfu/cm2（注：因为采样面积为100cm2，采样液总量为10mL，而实验仅用了2mL）。当2块平皿计算后cfu＞0，且＜10时，按A.3.5计算为＜1，报告时应为：≤1cfu/cm2。当2块平皿均为10，计算结果为1，报告时应为：1cfu/cm2。计算结果＞1，且＜100时，报结果时按四舍五入实数报。计算结果＞100时，按两位有效数值报告，如计算结果为1200cfu，报告为：1.2×10^3cfu。




4.3.2 手卫生采样面积为60 cm2，采样液10mL。CFU计算执行GB 15982 A.3.5，倾注培养时，2块平皿均未长菌，计算结果为：0；报告时应为：＜1cfu/cm2。当2块平皿计算后cfu＞0，且＜6时，按A.3.5计算为＜1，报告时应为：≤1cfu/cm2。当2块平皿均为6，计算结果为1，报告时应为：1cfu/cm2。计算结果＞1，且＜100时，报结果时按四舍五入实数报。计算结果＞100时，按两位有效数值报告，如计算结果为1200，报告为：1.2×10^3。




4.4如果某实验室长时间出现平皿未长细菌，应进行认真思考，最好组织科内的业务骨干进行讨论，或向有丰富临床检验的人员请教，考虑的问题包括现场采样方法是否正确，培养基质控结果，中和剂的选择与剂量，以及实验操作的各个环节等。而实验室的角度可以从以下几个方面进行论证：
①延长平皿的培养时间至5d、7d；
②剩余采样液加入营养液，增菌过夜后再接种平皿；如采样用中和剂中含有营养液，可直接将剩余采样液与接种了标本的平皿一起培养，发现采样液浑浊，表明有细菌生长繁殖；
③剩余采样液进行离心（3500rpm），取沉淀物1mL倾注培养，或取250μm涂布培养；
④剩余采样液全部过滤，滤膜进行培养；
⑤查看阴性、阳性对照结果。


总之，通常情况下，环境表面检测结果长时间未见阳性平皿时应从以上几个方面查找原因，及时改进，避免给临床科室做出误导的微生物实验结果。


至此，医疗机构环境表面微生物学检测技术之“环境微生物采样与检测环节”告一段落，感谢倪教授在百忙之中辛勤写作，为我们传经送宝。感谢大家的支持，最后呈上倪教授赠送的福利——《医院消毒灭菌质量监测方法与报告汇总表》。让您一表在手，搞定所有采样工作。




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图文编辑：小小牧童